Optimizarea mașinilor PCR în timp real convenabil

Dacă este PCR cantitativ cu fluorescență în timp real pentru cuantificarea virusului și genotiparea SNP, avem nevoie de o mașină PCR cu cea mai mare specificitate posibilă; Dacă este detectarea agentului patogen și mRNA, avem nevoie de o mașină PCR cu sensibilitate ridicată , deci cum ar trebui să optimizăm această mașină PCR?

Iată lista de conținut:

l Îmbunătățirea eficienței amplificării mașinii PCR

l Folosind primerii de mașină PCR în timp real pentru PCR general

Îmbunătățirea eficienței amplificării mașinii PCR

Pentru a îmbunătăți eficiența, specificitatea și sensibilitatea la amplificarea mașinii PCR , putem optimiza mașina PCR cantitativă cu fluorescență în timp real pentru experiment printr-o serie de măsuri. Prima este selecția secvenței țintă.

1, alegerea secvenței de țintă a mașinii PCR convenabile Lungime adecvată între 50 și 150bp. Secvențele mai scurte necesită mai puțin timp pentru a sintetiza și au timpi de amplificare mai scurti, astfel încât posibilitatea de a contamina ADN -ul amplificat este redusă.

2, atunci când selectați secvența țintă, utilizați BLAST Căutare pentru a analiza secvența țintă pentru polimorfisme și erori de secvențiere și evitați -le. Dacă există secvențe duplicate în secvența țintă, aceasta va reduce sensibilitatea la detectare a acestei mașini PCR și ar trebui, de asemenea, evitată.

3, controlați conținutul GC ≤ 60% în secvența țintă. Conținutul ridicat de GC, va afecta denaturarea secvenței țintă în ciclul termic, dar, de asemenea, ușor de produs această amplificare nespecifică a mașinii PCR.

4, evitați generarea de structură secundară. Secvențele țintă cu secvențe repetitive inversă sunt ușor de produs structură secundară, ceea ce afectează hibridizarea primerilor și sondelor de mașină PCR în timp real convenabil.

În plus, trebuie să ne asigurăm, de asemenea, că calitatea șablonului nu va afecta amplificarea, rezultatele mașinii PCR în timp real convenabile au fiabilitate. De exemplu, ADN -ul deteriorat nu poate fi amplificat în mod adecvat în mașina PCR sau deloc amplificat. De asemenea, prezența ADN -polimerazei care inhibă reactivi (DMSO etc.) și contaminanți (SDS, etc.) în șablon poate afecta fiabilitatea rezultatelor amplificării mașinii PCR.

Utilizarea primerilor de mașină PCR în timp real pentru PCR general

Obțineți primeri convenabili în timp real PCR , această metodă poate fi folosită și pentru PCR obișnuit.

1, lungimea trebuie să fie de 18-30bp pentru a asigura specificitatea legării.

2, temperatura de topire (valoarea TM) trebuie să fie de 55-60 ° C, iar valorile TM ale celor doi primer ar trebui să diferă cu 2-3 ° C.

3, fiecare primer ar trebui să aibă 1 până la 3 guanine sau citosine la capătul 3 ', ceea ce poate reduce în mod convenabil amplificarea nespecifică în timpul mașinii PCR în timp real. Mai mult de 3 se vor întoarce și vor provoca un 'efect glisant ' care duce la o extensie greșită.

4. Conținutul GC al primerilor ar trebui să fie în jur de 50%, conținutul prea mare de GC va crește valoarea TM.

5, primerii mașinii PCR ar trebui să evite secvențele repetitive inversă, deoarece va forma o structură secundară, afectând legarea primerului pe șablon.

6, dacă este RT-PCR, trebuie să evitați proiectarea primerilor pentru a se lega de secvențe de exon, ceea ce va duce la rezultatele experimentale ale mașinii PCR fals pozitive. Abordarea corectă ar trebui să fie proiectată pe flancul de intron lung, sau introni scurti, sau în toată regiunea de joncțiune exon-exon.

7. Desalting și purificarea primerilor.

Rețineți că, uneori, când ați făcut toate punctele, este posibil ca primerii să nu se amplifice, așa că ar trebui să reproiectați primerii.

Concentrându -se pe detectarea rapidă a acidului nucleic și detectarea rapidă a POCT, Bioteke oferă tipuri de instrumente de laborator ca: colectarea de eșantionare a virusului, extractorul automat de acid nucleic, mașina PCR și aparatul de disinfectare. Și oferă, de asemenea, multe tipuri de reactivi și kituri.